体内基因治疗最新研究进展及挑战

基因治疗是推动生物医学领域发展的一大动力，为许多遗传缺陷疾病提供了潜在的根治方法。按治疗途径分类，基因治疗可以分为体内基因治疗和体外基因治疗。近年来，体内基因治疗因其操作简便且能够规避预处理毒性的优势而备受关注。与此同时，各类精准基因编辑技术及载体递送技术的创新性突破进一步推动了科研人员对体内疗法的深入探索与研究。然而，当前体内疗法多数仍处于临床前研究阶段，从小鼠研究向人体研究的转化仍面临诸多挑战。本文致力于对国内外体内基因治疗领域的前沿研究进展进行部分梳理，并从多个维度深入剖析其面临的机遇与挑战。

体内基因治疗; 基因编辑; 递送技术; 靶向治疗; 挑战

基因治疗是指利用分子生物学等方法，在遗传物质层面进行操作和修饰，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗目的的一种医学手段。20世纪70年代，科学家开启基因治疗探索旅程; 20世纪90年代，开启临床试验并经历挫折; 近10年来，基因治疗迎来重新发展的契机。近年来，随着递送技术和基因编辑技术的不断迭代，基因治疗已经进入持续发展和突破阶段，为多种遗传性疾病和罕见病的治疗提供了新的希望。未来，基因治疗的适应证覆盖范围将持续拓展[1]。

按照导入人体的方式不同，基因治疗可划分为体内导入和体外导入2种形式。体内基因治疗是将外源基因(或基因编辑工具)通过适当的载体直接导入人体发挥治疗作用; 体外基因治疗则是先从患者体内获得细胞，在体外将外源基因(或基因编辑工具)导入细胞，制备成经基因修饰的细胞或细胞衍生产品，最终经回输发挥治疗作用(见图1)。

近年来，体外基因治疗在多种疾病中展现出巨大前景，然而，其可行性在产业化发展和制备工艺方面受到诸多安全性与技术性问题的制约。①体外基因疗法过程繁琐且耗时，周期较长，难以满足肿瘤等快速进展疾病患者的迫切治疗需求。②在制造过程中，存在物流和安全方面的挑战，技术要求高且成本昂贵。相比之下，体内基因治疗具有降低生产成本、缩短周转时间、过程简单且可避免因淋巴细胞清除术等操作带来的毒性风险等优势，能够为患者提供更大的便利，因而成为研究人员重要的探索和开发方向。

当前，替代疗法仍是体内基因治疗的主要手段，但随着各类精准基因编辑工具的出现，基因治疗的技术体系不断拓展，涵盖了基因编辑治疗、经基因修饰的细胞治疗、RNA治疗和溶瘤病毒治疗等。这些新技术和新理念，除了通过基因添加外，还可通过基因干扰、基因编辑(修饰、敲除、替代)、肿瘤杀伤(核酸疫苗、溶瘤病毒)等机制纠正细胞功能[2]。近年来，科学家开发出一系列强大的基因编辑工具，包括核酸酶编辑技术、碱基编辑技术和引导编辑技术，这些技术在治疗遗传性疾病的动物模型研究等临床前实验中已得到广泛应用，截至目前，全球已有15款体内基因编辑疗法进入临床试验阶段(见表1)[3]。

2.1 基因编辑工具1.0

常用的基因编辑工具包括锌指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator like effector nucleases，TALEN)和CRISPR-Cas系统，其作用机制主要涉及对特定基因组的精准识别、诱导DNA双链断裂(double strand break，DSB)，继而触发DNA修复等一系列复杂的生物学过程。相较于ZFN，TALEN存在可编辑靶点匮乏、编辑效率偏低且其操作繁杂、成本高昂、易脱靶等缺点，CRISPR-Cas核酸酶编辑技术突破了传统基因编辑的局限，具有易编程的特性，即可借助人工设计把crRNA与tracrRNA改造为单链引导RNA(single-guide RNA，sgRNA)，以此引导Cas蛋白于sgRNA配对的DNA靶位点剪切双链DNA，进而在基因编辑中得以广泛应用(见图2)。

2023年11月，美国FDA批准全球首款基于CRISPR的基因编辑疗法Casgevy上市，标志着基因编辑疗法正式迈入商业化阶段。Casgevy利用CRISPR/Cas9编辑增强子区域并抑制BCL11A的表达，增加患者CD34⁺造血干细胞中胎儿血红蛋白的表达水平以用于镰状细胞病治疗[4]。此外，本导基因公司开发的BD111是经国家药品监督管理局批准的我国首个体内基因编辑临床研究项目，同时也是全球范围内首个基于CRISPR技术的抗病毒基因编辑药物，该产品可利用病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)进行递送，直接靶向切割1型单纯疱疹病毒的基因组以清除病毒[5]。

2.2 基因编辑工具2.0

上述基因编辑技术存在双链断裂导致的基因毒性以及同源定向修复(homology-directed repair，HDR)效率低下等缺点，这些不足进一步推动了第二代CRISPR技术的发展。此类技术运用核酸酶缺陷型Cas蛋白，既保留基因组靶向能力，又能够在不依赖双链断裂和HDR的情况下介导基因组编辑，其中最具代表性的是碱基编辑器(base editor，BE)和引导编辑器(prime editor，PE)。与此同时，CRISPR/Cas13RNA编辑器、ARCUS^®核酸酶等新型技术的出现，进一步丰富了基因编辑技术的工具箱，为科研人员提供了多样化的选择。

2.2.1 碱基编辑

BE是一类基于CRISPR-Cas系统发展而来的新型基因编辑技术，主要包括胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor，CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor，ABE)，能够介导基因组中的单个碱基进行精确替换，即C→T和A→G[6]，为治疗单碱基突变遗传性疾病提供了新思路(见图2)。相比传统的基因编辑技术，BE具有更高的编辑效率和更低的脱靶风险。目前BE已经被反复证明可对多种活细胞和生物体的基因组进行点对点编辑，为人类从基因层面战胜疾病提供了希望。有研究证明，CBE能够将小鼠星形胶质细胞中与阿尔茨海默病相关的等位基因APOE4转化为APOE3r，同时还能纠正乳腺癌细胞中与癌症相关的p53突变Tyr163Cys。此外，研究人员还发现ABE可以在HEK293T细胞中纠正β-珠蛋白基因的突变，并在淋巴母细胞系中纠正铁贮积症遗传性血色素沉着症的致病基因突变[7]。Choi等[8]证明，ABE对Rpe65突变的校正可延长LCA小鼠模型中视锥细胞的存活时间，可用于Leber先天性黑矇症的治疗研究。

ABE的体内递送可纠正肌肉萎缩症小鼠模型中DMD基因的过早终止密码子。CBE可以定向突变斑马鱼的TYR基因，可以用于研究人类眼白化病中的基因突变[9]。

2.2.2 引导编辑

PE作为另一类独立于双链断裂和HDR的精确基因编辑工具，主要由工程化逆转录酶结合的切口酶nCas和引导编辑向导RNA组成[10-11]。相较于BE在单碱基转换类型上存在局限，PE具有实现所有12种单碱基的自由转换能力，同时在应用于多位点突变编辑或无须旁观者编辑时，其效率高于BE。PE还能介导多碱基精准插入或删除，可精确引入<40bp的插入片段或<80bp的缺失片段(见图2)。最新研究指出，扩增编辑作为一种新型PE工具已实现高达100Mb的可编程DNA复制，可将精确基因编辑的范围扩展到染色体规模[12]。目前PE已在基因治疗、疾病模型构建等多个研究领域展现出巨大前景，例如: Everette等[13]研究指出，PE能够在PCD小鼠模型中将镰状细胞病致病基因HBBS突变有效转换为野生型等位基因HBBA，成功扭转了小鼠的镰状细胞病表型，从而为镰状细胞病的基因治疗开辟了新的途径与思路。

2.2.3 CRISPR/Cas编辑器

CRISPR/Cas13系统主要靶向RNA发挥作用。Cas13蛋白在与特定的引导RNA结合后，能够识别并结合到与其互补的RNA序列上，然后发挥其RNA酶活性，对目标RNA进行切割，从而实现对RNA的编辑或调控等功能[14]。2024年8月，辉大基因公司针对杜氏肌营养不良症的Cas12/DNA编辑疗法HG302启动临床试验。同年9月，其针对MECP2重复综合征的Cas13/RNA编辑疗法HG204也启动临床试验，并获欧洲EMA的孤儿药资格认定及美国FDA的相关认定，标志着CRISPR基因编辑技术在特定领域的重大突破。

2.2.4 ARCUS^®核酸酶

ARCUS^®核酸酶是一种经过工程改造的核酸酶，具有特异性高、较小的相对分子质量等优势，可用于对特定DNA序列进行切割操作。例如，PBGENE-HBV是首款进入临床试验阶段的靶向乙型肝炎病毒慢性感染难以根治的关键因素，即共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的疗法。该疗法通过脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle，LNP)将编码ARCUS^®核酸酶的mRNA递送至肝脏。当在乙型肝炎病毒感染的肝细胞中表达时，ARCUS^®核酸酶可特异性切割乙型肝炎病毒DNA中高度保守的序列，旨在消除cccDNA并灭活整合到细胞DNA中的HBV基因[15]。

如何安全有效地实现基因工具的特异性靶向递送是体内基因治疗成功进行的关键。例如，在镰状细胞白血病等以造血干细胞为工具细胞的基因治疗中，体外疗法产品不断上市[13，16]，但因载体缺乏特异性靶向细胞的功能，体内疗法研究进程缓慢。体内递送基因工具需要满足一定的标准，包括精确的细胞靶向、高效的基因编辑和低毒性。目前，病毒载体和纳米载体被广泛探索用于体内递送构建(见图3)，尤其在体内嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)领域硕果卓越[17]。

3.1 病毒载体递送

用于体内基因递送的主要病毒类型包括慢病毒(lentivirus，LV)、腺病毒(adenovirus，AV)和腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，其中重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)是目前体内基因治疗产品中使用最广泛的载体。

rAAV是一种小型无包膜单链DNA病毒，具有低整合性、广宿主细胞范围、强扩散能力、高生物相容性、稳定表达及组织靶向性等独特优势[18]，主要用于大分子DNA的递送。截至目前，全球已获批上市的rAAV基因疗法共有8款(见表2)[19]，已成功在眼部、神经系统、代谢系统、血液系统、神经肌肉系统、心血管系统和肿瘤等多种疾病的临床试验中取得重大进展。此外，有研究结果显示，美国斯坦福大学成功开发出SELECTIV系统，该系统通过调节编码AAV受体基因的表达，实现了对特定组织或细胞类型的精确递送，并且在心肌细胞、肝细胞和胆碱能神经元中证实了其有效性[20]。美国博德研究所针对先导编辑技术开发了双AAV递送系统v1em和v3emPE-AAV，此系统在小鼠的大脑、肝脏和心脏中分别实现了高效编辑[21]。美国辛辛那提儿童医院医学中心利用骨骼肌特异性细胞融合蛋白myomaker和mymerger构建出新型包膜病毒载体，这一载体能够在杜氏肌营养不良小鼠中特异性靶向骨骼肌细胞[22]。

 LV主要用于离体基因递送，具有基因稳定性强、感染效能高、免疫原性较低、容量大等优点，目前已用于美国FDA批准的CAR-T疗法中。多项体内CAR-T细胞构建研究证明，LV经过不同的修饰改造可成功靶向T细胞递送CD19-CAR基因，包括抗CD3的scFv修饰、T细胞受体-CD3复合物(CD3-LV)修饰以及抗CD3抗体改造偶氮基团修饰等[23-25]。工程化双特异性DARPins-AAV2双重靶向CD4和CD32a，促进了靶向T细胞的体内CAR相关基因产生[26]。

3.2 非病毒载体递送

非病毒递送方式主要包括电穿孔、聚合物纳米载体(polymeric nanocarriers，PNC)、LNP、N-乙酰半乳糖胺修饰、外泌体(exosomes，Exo)、VLP等技术，目前已有多款产品上市(见表3)。其中PNC在体内递送中具有独特优势，主要表现为脱靶毒性和免疫原性极小、可大规模生产、能通过与靶向生物材料结合定制设计以及可经化学偶联和冻干处理延长稳定性等[17]，尤其在CAR-T细胞体内治疗研究中成果卓越(见表4)。例如: Smith等[27]开发了用于体内CAR-T疗法的PNC; Zhou等[28]开发了载有IL-6短发夹RNA(IL-6shRNA)和CD19-CAR组合(An-tiCD3-LNP/CAR19+shIL6)质粒的靶向CD3的LNP; Fan等[29]开发了用抗CD3和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)抗体修饰、肿瘤抗原刺激、树突状细胞衍生的外泌体(tDC-Exo)。Capstan Therapeutics公司利用mRNA-LNP平台，在心脏病小鼠模型中成功制造了体内CD5特异性CAR-T细胞[30]。此外，LNP在其他疾病研究中也屡获突破。例如: 2023年，美国费城儿童医院等机构研究人员利用针对CD117的抗体修饰LNP，构建CD117/LNP-mRNA，通过靶向修饰在小鼠体内外对造血干细胞(hematopoietic stemcell，HSC)进行高效编辑，为治疗血液疾病提供了新的策略和方法[31]。Breda等[32]制备了用抗造血干细胞和祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells，HSPC)膜受体c-KIT抗体修饰的LNP-mRNA，实现了在小鼠体内HSPC中有效递送原核位点特异性Cre重组酶，用于递送促凋亡分子以消耗小鼠体内的HSPC。

4.1 靶向T细胞的基因治疗

靶向T细胞的基因治疗涵盖多个方面，其中包括在HIV感染等病毒性疾病中的基因编辑疗法，通过对T细胞进行基因编辑对抗病毒感染; 同时还涉及改造T细胞免疫功能，如基因调控在抗肿瘤免疫治疗中的应用，通过改变T细胞的基因表达增强其对肿瘤细胞的免疫活性。2023年，美国纽黑文耶鲁大学研究团队通过利用抗人CD7抗体修饰的VLP，针对T细胞和单核细胞，成功进行sgRNA及CRISPR-Cas系统在人源化感染HIV-1小鼠体内的靶向递送，这是获得性免疫缺陷综合征基因治疗领域的一项重大进展[37]。2024年，INT2104成为首个被批准进入人体临床试验的体内CAR-T疗法。INT2104以抗CD7抗体靶向T细胞和NK细胞，并传递CAR转基因，以在体内生成效应CAR-T和CAR-NK细胞，用于治疗B细胞恶性肿瘤[38]。

4.2 靶向HSC的基因治疗

靶向HSC的基因治疗在某些血液病中得到应用，其基因修饰后的长期稳定性与功能维持是关键。2023年，美国宾夕法尼亚大学等采用HSC表面受体CD117的识别抗体修饰LNP表面，构建了靶向HSC的mRNA-LNP，并基于此实现了对HSC的体内直接基因编辑。在小鼠体内，该疗法成功靶向并调节了HSC功能，并对HSC移植实现了无基因毒性调节[31]。Generation Bio公司正在开发专门针对HSC的新型细胞靶向LNP系统，以在体内直接传递经过工程改造的RNA编辑器，旨在实现对镰状细胞病、β-地中海贫血及血友病等血液或免疫系统疾病更快速、更低成本的治疗[39]。

4.3 靶向肿瘤细胞的基因治疗

靶向肿瘤细胞的基因治疗策略持续演进，一方面，运用CRISPR/Cas9等编辑技术敲除肿瘤细胞中的关键致癌基因，如EGFR突变基因等，以抑制肿瘤细胞的增殖和存活; 另一方面，通过导入免疫调节因子基因，如IL-12，TRAIL等，增强机体的抗肿瘤免疫反应，使肿瘤细胞成为免疫细胞攻击的靶标。例如，有研究人员通过基因工程技术改造形成间皮素靶向的CAR-T细胞，又利用基因编辑技术在CAR-T细胞中引入编码IL-12等基因以进一步提高其对肿瘤细胞的识别及趋化等抗肿瘤能力[40]。美国国立癌症研究所将基因工程改造的溶瘤牛痘病毒(PEXA- VEC)与PD-L1抑制剂(durvalumab)或者CTLA-4抑制剂(tremelimumab)联合治疗结直肠癌。研究证明，溶瘤病毒除了直接的溶瘤活性外，还能诱导先天性和适应性免疫应答介导肿瘤细胞死亡，与免疫检查点抑制剂联合后，有望增强抗肿瘤效果[41]。

4.4 靶向其他组织细胞的基因治疗

此外，体内基因治疗在神经系统疾病、骨骼肌系统疾病、心血管系统疾病、眼部疾病以及其他遗传性疾病等多组织疾病的治疗中也已经取得了不同程度的进展。通过各种基因治疗策略和载体的应用，为这些疾病的治疗带来了新的思路和方法，部分临床试验也显示出了令人鼓舞的成果。例如: 在神经系统疾病中，神经退行性疾病如帕金森病(Parkinson's disease，PD)和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的基因治疗重在补充神经递质相关异常基因或调控神经细胞存活与炎症相关基因表达; 遗传性疾病如脊髓性肌萎缩症则聚焦致病基因的修复或替换。其他疾病方面，血友病通过导入基因改善凝血功能; 骨关节炎围绕调节关节软骨细胞代谢与炎症反应; 遗传性视神经病变探索修复受损视神经相关基因之法; 转甲状腺素蛋白淀粉样变性心肌病致力于修正异常基因表达以减缓心肌病变。对靶向不同细胞或组织类型的体内基因治疗最新进展的部分归纳见表5。

体内基因治疗面临多方面挑战与发展需求，如治疗载体的优化、基因表达的精准调控、免疫原性问题以及针对不同疾病复杂性制定个性化治疗方案等[56-57]。具体而言，在安全性上，病毒载体有插入突变、脱靶效应、免疫反应及增强组织炎症等风险，非病毒载体因安全可靠、稳定且不引发免疫系统反应而受重视，但精准靶向编辑与载体结构优化等新技术开发仍是关键。递送效率与组织特异性方面，加强纳米载体与靶向生物材料结合以及运用基因工程技术改造病毒载体结构对提升靶向递送效率意义重大。基因表达方面，注重载体选择与设计，例如采用稳定整合载体并添加增强稳定性元件等手段优化调控，可防止基因过度表达或失效。从伦理性来看，生殖系编辑存在改变遗传基因库、“设计婴儿”风险，可能致使后代遗传疾病或生理缺陷并加剧社会不平等，且因安全性担忧与长期疗效数据缺失使临床试验审批困难，虽美国、欧盟、中国已建立严格监管体系，但仍有待完善以保障可持续发展与公平可及。此外，体内基因治疗的高成本与复杂制造工艺限制了商业化进程，需借助技术创新与政策支持，如研发新型非病毒载体提高其可及性。

未来，随着基因治疗技术的不断创新和完善，有望在更多组织疾病的治疗中实现突破，为全球患者带来更多福祉。一方面，随着疾病靶点增多、碱基编辑等精准基因编辑技术的广泛开发和优化以及对有效递送方案的结合，在靶向多种组织疾病的研究中，体内基因编辑疗法正从动物模型的概念验证向临床试验过渡; 另一方面，基因疗法存在的安全性、有效性以及靶向性等多项挑战仍不容忽视。科研人员仍需攻坚克难，大力推动治疗策略的丰富发展，切实推动基因疗法研究的转化落地，争取早日完成更多体内基因治疗相关产品的开发及上市工作。